Beralih ke politik, Ali Jinnah bergabung dengan Kongres Nasional India pada 1906. Menjadi salah satu anggota Kongres yang sangat terhormat, dia terpilih sebagai Dewan Legislatif India di Delhi. Dia kemudian bergabung dengan Liga Muslim pada 1913, menjadi presiden lembaga itu untuk pertama kalinya pada 1916.
Ali Jinnah mundur dari Kongres pada 1920, ketika dia merasa kecewa atas kekerasan yang terjadi sehubungan dengan kampanye non-kooperasi yang dipelopori oleh Mahatma Gandhi. Kenyataan yang dilihat olehnya justru berlawanan dengan prinsip-prinsip anti-kekerasan yang diperjuangkan oleh Gandhi sendiri. Ali Jinnah masih berusaha untuk mempertautkan perbedaan-perbedaan antara kelompok Hindu dan Muslim. Tetapi perbedaan menjadi semakin tidak terjembatani pada 1928, ketika Nehru menolak 14 butir usulan kompromi konstitusional. Meskipun demikian, Ali Jinnah masih sempat hadir dalam tiga kali konferensi meja bundar (1930-32) di London.
Frustrasi atas pelbagai usahanya, Ali Jinnah pindah ke London untuk membuka praktek hukum. Dia kembali ke India pada Oktober 1935, ketika terpilih secara tetap sebagai Presiden Liga Muslim. Liga Muslim mengalami kekalahan besar dalam pemilu provinsi pada 1937, sementara Kongres, dipimpin oleh Gandhi dan Jawaharlal Nehru, memenangkan suara mayoritas 7 dari 11 provinsi. Ketidakbersediaan Kongres untuk membentuk pemerintahan koalisi dengan Liga Muslim, terutama di Provinsi Gabungan, menjadi babak akhir dari perpecahan Hindu-Muslim.
Pemisahan dengan India akhirnya disetujui pada 3 Juni 1947. Pakistan menjadi sebuah negara yang memiliki dua wilayah yang terpisah—bagian terpisah ini kemudian memecah lagi menjadi negara Bangladesh. Ali Jinnah menjadi Gubernur Jenderal dan Presiden Majelis Konstituante negara baru itu, dan memikul beban berat dalam pembentukan dasar negara Pakistan. Dia meninggal di Karachi pada 11 September 1948, membuat Pakistan sangat kehilangan tokoh politik ternama dan sangat berpengalaman.